Simultaneous detection of multiple pathogens by multiplex PCR coupled with DNA biochip hybridization

Traditional serological enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is routinely used to monitor pathogens during quarantine in most animal facilities to prevent possible infection. However, the ELISA platform is a single-target assay, and screening all targeted pathogens is time-consuming and laborious. In this study, to increase sensitivity and to reduce diagnosis time for high-throughput processes, multiplex PCR and DNA biochip techniques were combined to develop a multi-pathogen diagnostic method for use instead of routine ELISA. Eight primer sets were designed for multiplex PCR to detect genes from seven targeted bacterial and viral pathogens. DNA-DNA hybridization was conducted on a biochip following the multiple PCR analysis. Using this method, a total of 24 clinical samples were tested, and the result showed that not only single infection but also co-infection by multi-pathogens can be detected. In conclusion, multiplex PCR coupled with a DNA biochip is an efficient method for detecting multi-pathogens in a reaction. This platform is a useful tool for quarantine services and disease prevention in animal facilities. Resume Les epreuves serologiques ELISA traditionnelles sont couramment utilisees pour controler les agents pathogenes des animaux en quarantaine dans la plupart des animaleries, afin de prevenir toute infection. Cependant, la plate-forme ELISA est une epreuve a cible unique, et depister tous les agents pathogenes cibles s'avere un travail long et laborieux. Dans cette etude, pour augmenter la sensibilite et gagner du temps au moment du diagnostic dans les processus a haut debit, la PCR multiplexe et les techniques de biopuce a ADN ont ete combinees pour developper une methode de diagnostic d'agents pathogenes a utiliser au lieu du dosage ELISA habituel. Huit ensembles d'amorces ont ete concus pour la PCR multiplexe afin de detecter des genes issus de sept pathogenes cibles d'origine bacterienne et virale. L'hybridation ADN-ADN a ete effectuee sur une biopuce suite a l'analyse PCR multiple. En utilisant cette methode, un total de 24 echantillons cliniques ont ete testes et le resultat a montre qu'il etait ainsi possible de detecte non seulement les infections uniques mais egalement les co-infections par agents multi-pathogenes. En conclusion, la PCR multiplexe couplee a une biopuce a ADN est une methode efficace pour detecter les agents multi-pathogenes dans une reaction. Cette plateforme constitue un outil utile pour les services de quarantaine et de prevention des maladies dans les animaleries. Abstract Das herkommliche serologische ELISA-Verfahren wird wahrend der Quarantane in den meisten Tiereinrichtungen routinema ss ig zur uberwachung von Krankheitserregern angewandt, um potenzielle Infektionen zu verhindern. Die ELISA-Plattform ist jedoch ein Single Target Assay und das Screening aller spezifischen Erreger zeit- und arbeitsintensiv. In der vorliegenden Studie wurden zur Erhohung der Nachweisempfindlichkeit und Senkung der Diagnosezeit fur Hochdurchsatz-Prozesse Multiplex-PCR- mit DNA-Biochip-Verfahren kombiniert, um eine Diagnosemethode zum Nachweis mehrerer Erreger als Ersatz fur das ELISA-Routineverfahren zu entwickeln. Es wurden acht Primer Sets fur Multiplex-PCR zum Nachweis von Genen von sieben spezifischen bakteriellen und viralen Pathogenen konzipiert. DNA-DNA-Hybridisierung erfolgte auf einem Biochip im Anschluss an die Multiplex-PCR. Mit dieser Methode wurden insgesamt 24 klinische Proben getestet und das Ergebnis zeigte, dass nicht nur einzelne Infektionen, sondern auch Koinfektionen durch mehrere Erreger nachgewiesen werden konnen. Fazit: Die Kombinierung von Multiplex-PCR und DNA Biochip ist eine effiziente Methode zum Nachweis mehrerer Pathogene in einer Reaktion. Diese Plattform ist ein nutzliches Instrument fur Quarantane-Dienste und Krankheitspravention in Tiereinrichtungen. Resumen En la mayoria de instalaciones para animales se utiliza rutinariamente ELISA serologica tradicional para controlar patogenos en cuarentena con el fin de evitar una posible infeccion. No obstante, la plataforma ELISA es una prueba con un solo objetivo, y analizar todos los patogenos objetivo es laborioso y requiere mucho tiempo. En este estudio, para aumentar la sensibilidad y ahorrar tiempo de diagnostico en procesos de alto rendimiento, se combinaron tecnicas de biochip de ADN y multiplex PCR para desarrollar un metodo de diagnostico multipatogeno que utilizar en lugar de ELISA rutinaria. Se disenaron ocho conjuntos principales para multiplex PCR para detener genes de siete patogenos virales y bacteriales seleccionados. Se llevo a cabo una hibridacion ADN-ADN en un biochip tras un analisis de multiple PCR. Utilizando este metodo, se testaron un total de 24 muestras clinicas, y el resultado mostro que no solo se puede detectar una unica infeccion sino tambien coinfecciones por multiples patogenos. En conclusion, multiplex PCR junto con biochip de ADN es un metodo eficaz para detectar multiples patogenos en una reaccion. Esta plataforma se utiliza como una herramienta util para servicios de cuarentena y prevencion de enfermedades en instalaciones para animales.