调节miR-27b-3p和Nrf2对人RPE细胞代谢记忆形成的抑制作用

目的探讨微小RNA-27b-3p(miR-27b-3p)/核因子E2相关因子2(Nrf2)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞代谢记忆损伤的影响及其调控机制。方法取ARPE-19细胞, 将其置于5.5 mmol/L葡萄糖培养基培养6 d作为正常对照组;于30 mmol/L高糖培养基中培养3 d后, 换成5.5 mmol/L葡萄糖培养基继续培养3 d作为代谢记忆组;慢病毒转染细胞并加入嘌呤霉素, 筛选转染成功的细胞, 并将其置于30 mmol/L高糖培养3 d后换成5.5 mmol/L葡萄糖培养基继续培养3 d作为miR-27b-3p抑制剂组;细胞于30 mmol/L高糖+利拉鲁肽培养基培养3 d后换成5.5 mmol/L葡萄糖培养基继续培养3 d作为利拉鲁肽组。采用实时荧光定量PCR检测miR-27b-3p、Nrf2、醌氧化还原酶-1(NQO1)、血红素加氧酶-1(HO-1)mRNA表达水平;采用Western blot法检测Nrf2总蛋白、核蛋白水平;采用细胞免疫荧光检测Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达水平;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增生率以评估细胞活力;采用DHE试剂盒检测活性氧簇(ROS)水平。结果正常对照组、代谢记忆组、miR-27b-3p对照组和miR-27b-3p抑制剂组miR-27b-3p mRNA相对表达量分别为1.000±0.000、1.881±0.034、1.683±0.088和0.111±0.008, 总体比较差异有统计学意义(F=850.815, P<0.001), 其中, 正常对照组miR-27b-3p mRNA相对表达量低于代谢记忆组, miR-27b-3p抑制剂组miR-27b-3p mRNA相对表达量低于正常对照组, 差异均有统计学意义(均P<0.01)。代谢记忆组Nrf2 mRNA及总蛋白、核蛋白相对表达量较正常对照组降低, miR-27b-3p抑制剂组较miR-27b-3p对照组明显升高, 差异均有统计学意义(均P<0.01);代谢记忆组NQO1、HO-1 mRNA相对表达量较正常对照组降低, miR-27b-3p抑制剂组较miR-27b-3p对照组明显升高, 差异均有统计学意义(均P<0.01)。代谢记忆组Nrf2、NQO1、HO-1荧光强度均低于正常对照组, miR-27b-3p抑制剂组Nrf2、NQO1、HO-1荧光强度均高于miR-27b-3p对照组, 差异均有统计学意义(均P<0.01)。与代谢记忆组相比, 利拉鲁肽组miR-27b-3p mRNA相对表达量下降, 差异有统计学意义(P<0.05)。利拉鲁肽组Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA、Nrf2总蛋白及核蛋白相对表达水平均较代谢记忆组升高, 差异均有统计学意义(均P<0.05), 利拉鲁肽组荧光强度较代谢记忆组增强, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。与正常对照组及利拉鲁肽组相比, 代谢记忆组细胞增生活力均下降, 差异均有统计学意义(均P<0.01)。代谢记忆组ROS相对含量较正常对照组及利拉鲁肽组升高, 差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论利拉鲁肽通过下调miR-27b-3p逆转代谢记忆对Nrf2、NQO1和HO-1的抑制作用。