高分辨率溶解曲线分析结合COLD-PCR快速检测绵羊低丰度FecB基因

本文利用高分辨率熔解曲线分析结合COLD-PCR建立绵羊骨形态发生蛋白受体IB(BMPR-IB)基因低丰度A746G点突变的检测方法,为Fec B基因大面积高通量筛查提供方便快捷和低成本的检测技术。实验分别提取绵羊BMPR-IB基因A746G点突变阳性纯合子和阴性纯合子的基因组,分别PCR扩增223 bp的目的片段,测定浓度和纯度后,分别稀释至0.05 ng/μL,将阳性纯合子用阴性纯合子进行系列稀释作为模板标准品。根据模板标准品序列设计合成3对引物,以标准品为模板进行COLD-PCR,其产物进行高分辨率熔解曲线分析,生成的归一化温度转移差异图(Normlized and Temp-Shifted Differines Plot)即为标准曲线图,作为待测样品Fec B检测的依据,对其可靠重复性做了进一步验证。结果表明:2对引物COLD-PCR HRM标准曲线图曲线分离清晰可靠,检测下限均为0.5%,与传统q PCR HRM相比,灵敏度提高到4倍。本实验建立的绵羊低丰度Fec B基因检测方法可以用于绵羊Fec B基因大面积高通量快速筛查工作。