人同型融合和蛋白质分选复合体亚基的原核表达、蛋白纯化及功能验证

被引：3
作者：
陈玉
郭仁朋
黄赛飞
宋丹
刘蓉
机构：
[1] 南京农业大学食品科技学院
来源：
生物工程学报 | 2020年 / 01期
关键词：
人同型融合和蛋白质分选复合体(HOPS); 原核表达; 蛋白纯化; 自噬;
D O I：
10.13345/j.cjb.190133
中图分类号：
Q78 [基因工程（遗传工程）];
学科分类号：
071007 ; 0836 ; 090102 ;
摘要：
同型融合和蛋白质分选复合体(HOPS)由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41这6种蛋白组成,能够通过膜融合机制来调节生物体内的膜泡运输。已有研究表明其可以作为融合因子来促进自噬体与溶酶体膜融合过程。为在体外确定HOPS复合体与自噬性SNARE蛋白STX17是否具有直接相互作用,首先利用PCR技术从已有质粒中扩增得到6种基因的编码序列,将其连接至pGEX 4T-1-GST或pET-His-NusA原核表达载体上,经菌落PCR初步鉴定和DNA测序无误后成功构建6种原核表达重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3);利用谷胱甘肽琼脂糖树脂与镍柱对重组蛋白进行纯化,烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶酶切掉GST或His-NusA标签,得到分子量约为105 kDa的HA-VPS11蛋白、97 kDa的Flag-VPS16蛋白、108 kDa的HA-VPS18蛋白、70 kDa的Flag-VPS33蛋白、97 k Da的HA-VPS39蛋白和98 kDa的Flag-VPS41蛋白;通过体外GST pull-down技术对6种蛋白的功能进行验证,证实自噬性SNARE蛋白STX17和6种重组蛋白在体外均具有直接相互作用,为深入探究HOPS复合体参与自噬体与溶酶体膜融合过程中的功能及作用机制奠定实验基础。
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页数：10
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