基于多重实时荧光PCR技术快速检测海产品异尖线虫

【目的】构建简单异尖线虫（Anisakis simplex）、费氏宫脂线虫（Hysterothylacium fabri）、内弯宫脂线虫（Hysterothylacium aduncum）、拟地新线虫（Pseudoterranova decipiens）、典型异尖线虫（Anisakis typica）、带鱼针蛔线虫（Raphidascaris trichiuri）、厦门宫脂线虫（Hysterothylacium amoyense）和中华宫脂线虫（Hysterothylacium sinense）的快速检测方法，实现对以上8种异尖线虫的高通量检测及准确分型。【方法】采集8种异尖线虫核酸进行凝胶电泳，测序并进行序列对比，设计引物和TaqMan荧光探针；通过优化体系及退火温度，建立多重实时荧光PCR检测体系，并添加海产品核酸背景验证其特异性和灵敏度。【结果】建立了基于多重实时荧光PCR技术针对海产品中异尖线虫的快速检测鉴定方法，可在一个反应体系里同时检测鉴定4种异尖线虫，双通道反应体系可一次性检测鉴定8种异尖线虫。体系中，引物和探针的终浓度分别为0.60、0.20μmol/L,DNA灵敏度为10～3拷贝/mL；对带鱼（Trichiurus lepturus）、鳕鱼（Gadus）、舟山宫脂线虫（Hysterothylacium zhoushanensis）、棘颚口线虫（Gnathostoma spinigerum）均无荧光信号；针对等量混合的4种异尖线虫模拟样本均可检出，检出限为1.0%。【结论】建立的海产品异尖线虫多重实时荧光PCR快速检测方法操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好，可应用于日常食品检验和异尖线虫分型鉴别研究。