ATF6与IRE1XBP1在氧糖剥夺/复氧损伤HT22细胞中的交互作用

目的研究转录激活因子6(ATF6)与需肌醇酶1-X-框结合蛋白1(IRE1-XBP1)在氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤小鼠海马神经元(HT22)细胞中的交互作用。方法复制OGD/R损伤HT22细胞模型, 观察OGD/R后不同时间点(0、3、6、12、24 h)内质网应激(ERS)、细胞活性和凋亡的变化。将对数生长期的HT22细胞分为空白对照组、对照+ATF6激动剂AA147组、对照+IRE1抑制剂4μ8c组、OGD/R模型组、OGD/R+AA147组、OGD/R+4μ8c组(AA147组和4μ8c组于全程添加10 μmol/L AA147或16 μmol/L 4μ8c)。采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测各组HT22细胞ERS相关蛋白〔葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化需肌醇酶1(p-IRE1)、磷酸化真核细胞翻译起始因子2α(p-eIF2α)〕以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、活化caspase-3的表达;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ERS相关基因以及ATF6〔同型半胱氨酸内质网应激泛素样结构域1(Herpud1)、蛋白二硫键异构酶家族成员4(Pdia4)、Lin-12样抑制子/增强子(Sel1L)〕和剪接型X-框结合蛋白1〔XBP1s, 包括DnaJ热休克蛋白成员B9(Erdj4)、Sec24相关基因家族成员D(Sec24d)、信号受体序列3(Ssr3)〕介导的转录反应相关基因的mRNA表达;采用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞活性;采用免疫荧光法检测活化caspase-3表达。结果与空白对照组比较, ERS相关蛋白p-IRE1和p-eIF2α的蛋白表达量分别在OGD/R 12 h、OGD/R 3 h升高(p-IRE1/β-actin:2.09±0.10比1.00±0.00, p-eIF2α/β-actin:1.39±0.11比1.00±0.00, 均P<0.01), ERS相关基因ATF6、XBP1s、非剪接型X-框结合蛋白1(XBP1u)、转录激活因子4(ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的mRNA表达量在OGD/R后不同时间点也明显升高, 表明ERS在OGD/R作用的HT22细胞中被激活。与OGD/R模型组比较, OGD/R+AA147组p-IRE1蛋白表达量无改变, 但XBP1s和XBP1u的mRNA表达量明显下降〔XBP1s(2-ΔΔCt):0.76(0.71, 0.92)比1.13(1.03, 1.29), XBP1u(2-ΔΔCt):0.29±0.05比0.52±0.04, 均P<0.01〕, 而XBP1s介导的转录反应相关基因表达量无明显改变。与OGD/R模型组比较, 在使用4μ8c后短链ATF6(sATF6)和GRP78的蛋白表达量无明显改变, ATF6介导的转录反应相关基因的mRNA也无明显改变。提示ATF6的激活能抑制XBP1s和XBP1u的mRNA表达, 但ATF6与XBP1s介导的转录反应无交互作用。与空白对照组比较, HT22细胞活性在OGD/R 3 h时显著降低〔(44.64±5.12)%比(99.13±5.76)%, P<0.01〕, 凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值和活化caspase-3/caspase-3比值分别在OGD/R 3 h和OGD/R 0 h显著升高(Bax/Bcl-2比值:6.15±1.65比1.00±0.00, 活化caspase-3/caspase-3比值:17.48±2.75比1.00±0.00, 均P<0.01), 表明凋亡在OGD/R作用的HT22细胞中被激活。与OGD/R模型组比较, OGD/R+AA147组细胞活性显著下降〔(36.52±17.78)%比(69.90±9.43)%, P<0.01〕, Bax/Bcl-2比值和活化caspase-3/caspase-3比值明显升高(Bax/Bcl-2比值:2.06±0.31比1.10±0.25, 活化caspase-3/caspase-3比值:3.35±0.59比0.55±0.09, 均P<0.01)。结论在OGD/R损伤HT22细胞中, ATF6和XBP1s介导的转录反应无明显交互作用, 但AA147激活的ATF6能抑制XBP1s和XBP1u的mRNA表达并促进应激HT22细胞中死亡的发生。