大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切。开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程。本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24。BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1221bp,预测编码406个氨基酸。利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrTCP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系。用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17%,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53%。这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能。通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5μmolNAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化。为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中。通过卡那霉素筛选以及基因组DNAPCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株。通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因。利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组。进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小。此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达。这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育。